自私基因元件（Selfish genetic element）对于原核生物（prokaryote）可不一定是一无是处的。我们都知道病毒可以通过重编程宿主细胞（reprogramming host cell）的方式进行大量复制，也可以像“偷渡客”一样整合到宿主细胞的基因组里潜伏起来伺机作乱；可接合质粒（conjugative plasmid，又称作转移性染色质外DNA）可以赋予宿主细胞新的优势特性，比如获得某种抗毒素因子，这样细胞就会像吸毒上瘾一样不愿意丢失这些质粒，还有很多这类外来DNA赖在细菌等细胞中不走的事例这里就不一一介绍了。不过细菌（bacteria）和古细菌（archaea）都有一套防御机制抵御这种外来的侵入性因子，这种防御机制就是在成簇的、有规律间隔的多次重复短片段（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）的基础上建立起来的适应性免疫系统
（adaptive immune system）。Jinek等人最新的研究成果发现，细菌细胞里的CRISPR效应酶蛋白Cas9因子不是通过一个RNA，而是一对小RNA分子来清除入侵的外源DNA片段。
CRISPR系统能够将各种外源的病毒或质粒DNA短片段“集中”到细胞基因组里某个特定的重复片段区域上，将这些外源DNA当作细胞曾经经受过外源DNA入侵的一种记忆给储存起来。然后这段DNA会转录生成CRISPR前体RNA（precursor CRISPR RNA），前体RNA生成之后会被切割成一段一段的重复RNA片段，这些小RNA分子就是成熟的CRISPR RNA（crRNA）。然后crRNA会招募CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）与各种被细胞记住的外源的入侵DNA或mRNA片段结合，将它们彻底摧毁。 科学家们是在大约5年前才开始了解到CRISPR的，当时他们发现如果将某种病毒的DNA片段掺入细菌之中，细菌就会对随后再次感染的同种病毒产生极高的免疫力。细菌就是从之前入侵的病毒DNA片段那里认识了这种病毒，从而获得了免疫力，当病毒再次入侵的时候细菌编码的Cas9因子就可以发挥作用，消灭来犯的病毒。但是当时还不清楚这种Cas9因子的具体作用机制。 科学家们首先需要解决的问题就是搞清楚Cas9因子是如何获得成熟的crRNA的。在大部分CRISPR-Cas系统里都少不了这样一位主角，那就是将CRISPR前体RNA切割成一小段一小段小RNA分子的专一性核酶（nuclease）。除了成熟的crRNA之外，这些Cas9因子还需要另外一种CRISPR特异性的小RNA
（CRISPR-specific small RNA）的帮助，我们把这种小RNA称作反式激活的crRNA（tracrRNA），因为这种小RNA刚好与crRNA的小片段互补，同时它们还是RNA特异性的宿主核糖核酸酶RNase III的底物。经过RNase III的切割之后，这一对互补的RNA（其中包括一条42bp的crRNA和一条75bp的tracrRNA）就可以充当Cas9因子的向导，帮助它“打鬼子”了。
Jinek等人就在此基础之上继续进行了更深入的研究，他们发现化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）编码的Cas9蛋白也能够与细菌熟悉的入侵DNA结合，并将其降解。虽然我们知道切割位点只能由crRNA决定，但是科学家们却惊奇地发现，Cas9蛋白与目标DNA结合以及切割的过程还必须有tracrRNA分子的参与。也就是说，tracrRNA分子能够帮助Cas9-crRNA复合体在细胞复杂的DNA环境中精准地定位到入侵的DNA序列上，如附图所示。这也进一步说明小RNA分子的确是细胞里不可或缺的一份子。
瑞士军刀样的多功能蛋白。（A）Cas9蛋白需要crRNA和tracrRNA的共同帮助才能识别入侵的外来DNA分子，与之结合并将其降解。因为crRNA中
的向导链部分可以与外源DNA的一条链互补并结合形成R环结构。在被识别区域两端的DNA基序也起到了非常重要的作用，它们可以帮助DNA链结旋打开双链，有利于crRNA链侵入。然后靶标DNA会在Cas9蛋白两个核酶结构域的作用下被切断。（B）级联反应复合体里含有一个crRNA，可是却最多携带了5种不同的Cas蛋白。所以它能够持续不断地招募核酶和解旋酶Cas3蛋白，不停歇地将入侵的外源DNA打开并切断。
Cas9蛋白能够凭借分子内的两个核酸酶结构域切割靶标DNA分子，形成平末端产物，其中每一个结构域负责切割靶标DNA分子R环状（R-loop）结构中的一条DNA链，具体来说，就是一个HNH核酶结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，RuvC核酶结构域负责切割另外一条DNA链。Jinek等人发现这种切割的效率非常高，而且不论靶标DNA分子是松弛型的，还是紧密的超螺旋型的都可以被毫不费力地被切割开，说明Cas9蛋白在细胞里是循环使用的，这样能保证在第一时间将所有来犯的入侵者全都消灭掉。 这种防卫机制虽然很有效率，但它也存在致命的阿喀琉斯之踵。比如病毒就可以通过突变的方式轻易地突破这道防线。Jinek等人在对这种突变DNA分子进行研究的时候发现Cas9蛋白对突变DNA的结合能力和切割能力都会大打折扣，这说明病毒完全能够应付细菌这套免疫机制，也说明细菌需要重新修正记忆内容才能够面对新一轮攻击。魔高一尺道高一丈，千百年来细菌与其寄生者之间就在不断地重复这套攻守流程，最后大家共同进化。
Jinek等人还敏锐地意识到这种高度特异性的由RNA介导的DNA核酶刚好可以被我们用来对基因组进行特异性的改造。从理论上来说，只需要一段20bp的crRNA做向导，核酶就可以在真核生物基因组的任意位置进行特异性切割。为了验证这个想法Jinek等人使用一个携带了绿色荧光蛋白GFP编码基因的质粒进行了实验。他们根据某个位点设计了一套crRNA和tracrRNA，结果Cas9蛋白就在预定位点准确地完成了切割任务。DNA断裂之后还激活了细胞内的DNA断裂修复机制，科学家们利用这种反应就可以对细胞内的某个基因进行破坏、插入或者修复等操作了。使用Cas9蛋白和crRNA在DNA上引入特异性断裂这样一套技术对我们现有的锌指核酶技术（zinc finger nucleases）
和转录激活效应因子样核酶技术（transcription activator–like effector nucleases）等基因靶向操作技术（gene-targeting technologies）是一个很好的补充和完善，因为这些现有技术都需要针对每一个靶点重新设计核酶。有了这种基因改造和修复技术我们就可以对患者的病变细胞进行修复，然后再将修复好的细胞重新回输到患者体内，这样就可以对多种遗传缺陷疾病进行很好的治疗了。 和CRISPR系统里的其它效应分子相比，Cas9蛋白明显要重要得多，它是一个单一的、具有多种酶活性的蛋白，分子量通常介于350kD至450kD之间，最多的时候可以由11个亚基组成，编码Cas9蛋白的基因也有4至7个之多。可是这么庞大的一个蛋白却只有在结合了靶标DNA之后才会再招募其它亚基，使Cas9蛋白具有核酶活性。也就是说，Cas9蛋白就好像一把瑞士军刀一样，有很多的组成部件，所以也有众多的功能，CRISPR系统正因为有了这个多面手才能不惧任何外来的威胁。
原文检索：
Stan J. J. Brouns. (2012) A Swiss Army Knife of Immunity. Science, 337:808-809. YORK/编译
名词解释：
CRISPR/Cas (CRISPR associated systems)： CRISPR/Cas系统（CRISPR相关系统）， CRISPR（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat）即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌（archaea）胞内起到了一种获得性免疫（acquired immunity）的作用。CRISPR系统主要依赖crRNA和tracrRNA来对外源DNA进行序列特异性降解。目前已经发现了3种CRISPR/Cas系统，其中在2型系统（type II systems）中依赖的是Cas9蛋白。在RNA的介导下，Cas9蛋白能够对crRNA–tracrRNA识别的靶序列进行切割。