第40卷增刊2013年

JournalofBeijingUniversityofChemicalTechnology(NaturalScience)

北京化工大学学报(自然科学版)

Vol.40,Suppl.

2013

固定化苍白杆菌PW降解芘的研究

(1郾北京化工大学化学工程学院,北京摇100029;2郾北京金隅股份有限公司,北京摇100031)

摘摇要:以海藻酸钠和聚乙烯醇为混合载体,采取包埋法固定化苍白杆菌PW,降解培养基中的芘。在实验中分析了固定化载体浓度对固定化小球机械强度和传质系数的影响;绘制出固定化PW菌和游离菌降解芘的动力学曲线,比较了二者的差异;分析了pH值和温度对PW菌降解芘的影响。研究结果表明:随着海藻酸钠浓度的提高,固定化小球的传质性能变好,机械强度提高;随着聚乙烯醇的浓度的提高,固定化小球的传质性能变差,机械强度提高;在同样的条件下,固定化PW菌降解芘的效果要优于游离菌;固定化PW菌降解芘的最适pH为6郾5~7郾5,最适温度为30益左右。

关键词:海藻酸钠;聚乙烯醇;固定化PW菌中图分类号:X582

李摇强1摇候光胜2摇林爱军1*摇杨晓进1摇魏连爽1摇熊摇思1

引摇言

固定化微生物技术是20世纪70年代兴起的一种生物修复技术,它不仅能够有效地解决污水处理中微生物细胞太小、与水难以分离、易造成二次污染的难题,以及土壤修复中土著菌的恶性竞争和微生物难以适应环境的问题,而且还具有保持污水和土壤处理的高效率和稳定性,以及保持纯种和高效菌种的优点[1-3]。

影响微生物固定化的因素有很多,包括温度、pH值以及载体浓度等,筛选最适的微生物固定化条件是目前国内外研究热点。如曹国明等[4]在研究固定化微生物在好氧条件下,同时硝化和反硝化的实验中得出对于硝化菌和反硝化菌混合固定的单级脱氮过程,最适pH值为8郾2左右,最适合温度为30益左右。童群义等[5]采用PVA-卡拉胶混合载体固定化大肠杆菌酵母菌混合体系生产谷胱甘肽(GSH),随着PVA浓度的增加,载体的机械强度明显增加,但在机械强度增加的同时,传质阻力增加、GSH产量下降。综合考虑载体强度和GSH产量,PVA质量分数为10%。Banerjee等[6]用海藻酸钠固定化芽孢杆菌AKG1菌和AKG2菌降解苯酚,发

收稿日期:2013-01-31

基金项目:国家自然科学基金(40901149)第一作者:男,1988年生,硕士生*通讯联系人

现最适合pH分别为6郾7和6郾9,最适合海藻酸钠质量分数为3%左右。Celis等[7]在乳酸发酵过程中,为了防止细胞泄露,采用聚丙烯酰胺凝胶固定化鼠10%丙烯酰胺AA和l%N,N忆鄄亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)时,生物量泄漏量最小,具有最佳渗透特阻止了固定化微生物的物质利用,直至固定化细胞5%,固定化微生物不稳定,不适宜细胞固定化。分解才能够完全用乳糖;当载体AA质量分数小于

芘作为多环芳烃的四环代表物,属于土壤的难性。当载体AA质量分数大于15%时,晶格密度大,李糖乳杆菌ATCC7469,结果发现当凝胶的组成为

降解有机污染物,进入土壤系统的多环芳烃具有危害人类健康和环境的潜在危险,是一种致癌和致畸物[8]。本文以PW菌为菌株,以芘为被降解物,研究固定化载体、温度、pH等因素对固定化PW菌降解芘的影响,以及固定化PW菌和游离菌在降解芘的效果方面的对比,为将固定化PW菌应用于降解泥浆反应器中被污染土壤中的多环芳烃提供指导,以期为治理北京市因企业搬迁遗留下来多环芳烃污染土壤开发出新的治理方法。

1摇材料与方法

1郾1摇实验材料1郾1郾1摇菌株

PW菌是谢文娟等[9]从北京市当地污染土壤

中,利用分离筛选的办法,得到的一株环境耐受性

增刊摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇李摇强等:固定化苍白杆菌PW降解芘的研究·37·

1郾1郾2摇实验试剂

芘(pyrene,纯度>99%)购自AlfaAesar公司,溶于丙酮制成储备液;正己烷和丙酮为色谱纯;其他1郾1郾3摇主要培养基剂均为分析纯。

固定化小球,放在培养皿上,将盛固定化小球的培养皿放在天平上,用培养皿盖压包埋小球,观察固定化小球被压碎时所用的力的大小,所用力越大,固定化小球机械强度越强。

Table1摇Massfractionofpolyvinylalcoholandsodium

处理编号12345

w海藻酸钠/%22233

5郾22g/LK2HSO4,2g/L(NH4)2SO4,0郾2g/LMg鄄7郾2。

SO4,1mg/LCaCl2和1mg/LFeSO4·7H2O,pH为7~

无机盐培养基(MSN):10郾02g/LNa2HSO4,

表1摇固定化小球中聚乙烯醇和海藻酸钠质量分数

alginateinimmobilizedbeads

w聚乙烯醇/%46846

处理编号6789

w海藻酸钠/%3444

w聚乙烯醇/%8468

富集培养基:经过灭菌后的MSN培养基加入

芘,使芘的最终质量浓度为100mg/L。交联液(2%培养基在121益下灭菌30min。

CaCl2的饱和硼酸溶液):20g/LCaCl2,40g/L硼酸。1郾2摇实验方法

1郾2郾1摇PW菌的驯化和培养

将PW菌在灭菌后的固体MSN培养基平面上于30益下培养48h后,接种到含100mg/L芘的经灭菌后的液体MSN培养基中,在30益恒温振荡箱1郾2郾2摇PW菌的固定化方法中培养5~7d,如此重复多次。

取适量的聚乙烯醇加入到100mL的锥形瓶中,加入0郾1g活性炭,提高固定化小球的机械强度,加入16mL的去离子水,在90益水浴加热溶解聚乙烯醇,再加入适量的海藻酸钠,摇匀。将载体混合液灭菌,待冷却后在无菌环境中加入4mL的培养6d的菌液,摇匀,用注射器取8mL的混合液注入到50mL的经灭菌冷却的交联液中,防止固定化小球之间相互连结,交联24h,交联完毕用无菌水洗涤后保存1郾2郾3摇PW菌对芘的降解

本实验的所有培养基都是40mL含芘100mg/L的MSN培养基,每个实验组设置3个重复。对于游离PW菌,往里加入1郾6mL培养6d的PW菌悬浮液,对于固定化PW菌,载体中海藻酸钠和聚乙烯醇为最适浓度,其中固定化PW菌浓度与游离菌的浓7,在30益恒温振荡箱中培养[9]。从第2天开始,每1郾3摇分析方法

天取一组样测定其中芘的含量。

1郾3郾1摇固定化小球传质性能和机械强度的测定

本实验以聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠作为混合固定化载体,每个实验组设置3个重复,具体实验度相同。游离菌和固定化PW菌培养液的pH都为备用。

摇摇每个实验组另取10粒大小一致的包埋小球,各加入到盛有50mL去离子水锥形瓶中,往里各滴入3滴惰性红墨水,5min后,将固定化小球取出,用去离子水冲洗后放到培养皿上,用剃须刀片切开固定化小球,观察红墨水的侵蚀程度,侵蚀程度越大,固定1郾3郾2摇芘的质量浓度的测定

将培养结束后的培养液用同体积的正己烷萃取其中的芘,萃取完毕后用无水硫酸钠吸水5min,用样品瓶取一瓶上清液,保存在-20益的环境中,待测。取1滋L待测液注入到气相色谱仪中,测定其质160mg/L区间呈线性(R2=0郾9949)。

量浓度。研究中采用外标法定量,芘标准曲线在0~化小球传质性能越好。

2摇结果与讨论

质性能的影响

2郾1摇载体质量分数对固定化小球的机械强度和传

利用海藻酸钠和聚乙烯醇混合固定化制得固定化小球测载体质量分数对固定化小球的传质性能和机械强度的影响的实验结果如表2和表3所示。从表2中可以看出,随着海藻酸钠质量分数的提高,固定化小球的传质性能变好,而机械强度也增强。但在实验中发现,海藻酸钠质量分数提高时,成球的难度也相应提高,而且,在海藻酸钠质量分数为4%时,固定化小球有明显的尾巴,甚至有部分小球成蝌蚪状,这说明,并不是海藻酸钠浓度越高越好。这与他人的部分研究结果[10]类似。从表3可以看出,随

·38·北京化工大学学报(自然科学版)摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇2013年

变差,机械强度变好。有研究[11]表明:聚乙烯醇具有良好的流变学性能(不易碎),但其传质性能不如海藻酸钠。因此,随着聚乙烯醇质量分数提高,聚乙烯醇在固定化小球中的比重升高,固定化小球的传1所示。

质性能变差,机械强度提高。固定化小球形态如图

表2摇海藻酸钠质量分数对固定化小球的Table2摇Effectofmassfractionofsodiumalginateonthe

ofimmobilizedbeads

+

的浓度的降低,使得固定化PW菌对芘的降解趋于平缓,6d时,固定化PW菌基本能够将芘降解完毕。后期,游离菌对芘的降解速率逐渐提高,7d之后,游离菌基本能够将芘降解完全,降解率和固定化PW菌的效果相差无几。这与他人的研究结果[9-10]类似。前期固定化PW菌对芘的降解速率远远高于游离菌是由于2个方面的原因:(1)固定化载体对芘具有吸附作用[12];(2)芘对PW菌具有一定的毒害亡,由于固定化载体的保护作用固定化PW菌受到芘的毒害作用低于游离菌,所以固定化PW菌对芘的降解率要高于游离菌。后期,由于溶液中芘的浓度降低,固定化PW菌缺少足够的碳源,生长速率降低,对芘的降解速率下降。而游离菌在度过适应期后,由于培养基中富含其所需的能源,从第4天开始,其生长速率大幅提高,对芘的降解速率也大幅提高

。

作用。前期由于游离菌受到芘的毒害作用而大量死

机械强度和传质性能的影响

mechanicalstrengthandmasstransferperformance

传质性能++

机械强度+++

w海藻酸钠/%

23

摇摇

4

性能越好

+的数量越多,表示和其他实验组相比,机械强度越大或者传质

++++++

表3摇聚乙烯醇质量分数对固定化小球的机械Table3摇EffectofmassfractionofPVAonthe

performanceofimmobilizedbeads

传质性能++++++

强度和传质系数的影响

mechanicalstrengthandmasstransfer

机械强度+++

w聚乙烯醇/%

468

++

+

图2摇固定化PW菌和游离PW菌对芘的降解Fig.2摇Degradationofpyrenebyimmobilized

PWbacteriaandfreePWbacteria

2郾3摇pH值对固定化PW菌降解芘的影响

固定化PW菌在pH为4~10的区间范围内对芘的降解效果如图3所示。从图3中可以看出,在的降解效果,其降解率都在85%以上。在pH低于6郾5时,随着pH增大,固定化PW菌对芘的降解效果成上升趋势,在pH大于7郾5时,随着pH增大,固定化PW菌对芘的降解效果成下降趋势,其最适pH值处于6郾5~7郾5之间。但在pH为6~10之间时,固定化PW菌对芘降解效果的差异并不大,这与资料上显示的游离PW菌在pH高于7之后,其降解效果急剧下降有一定的差异[9],这说明,固定化载体能够提高PW菌对碱性条件的耐受作用。2郾4摇温度对固定化PW菌降解芘的影响

pH为6~10的范围内,固定化PW菌对芘都有不错

2郾2摇游离菌和固定化PW菌降解芘效果的对比利用游离PW菌和固定化PW菌在适宜条件下降解芘的实验结果如图2所示,从图2中可以看出,在前期固定化PW菌对芘的降解速率要远远高于游Fig.1摇Formoftheimmobilizedbeads

图1摇固定化小球的形态

增刊摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇摇李摇强等:固定化苍白杆菌PW降解芘的研究·39·

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图3摇固定化PW菌在6d时于不同的pH值Fig.3摇DegradationratioofpyrenebyimmobilizedPW

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图4所示。从图4中可以看出,在温度低于30益时,固定化PW菌对芘的降解效果随着温度的提高而提高,而高于30益后,随着温度的提高,固定化芘的最适pH约为30益

。

PW菌对芘的降解效果而降低,固定化PW菌降解

bacteriaatdifferentpHvaluesonthesixthday

图4摇固定化PW菌在6d时于不用的Fig.4摇DegradationratioofpyrenebyimmobilizedPW

温度条件下对芘的降解率

[6]摇BanerjeeA,GhoshalAK.Phenoldegradationperform鄄

2000,30(4):1-5.(inChinese)

在温度偏离最适温度1~2益时,其降解率大幅度下降,固定化PW菌降解芘对温度的敏感度偏高,这与预期中的实验结果不符[4,9]。这可能是因为在实验过程中,不同温度的实验组所使用的恒温振荡箱不同所致。

bacteriaatdifferenttemperaturesonthesixthday

ancebyisolatedBacilluscereusimmobilizedinalginate

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海藻酸钠和聚乙烯醇(PVA)作为混合载体固

定化PW菌制取固定化小球的最适载体浓度为3%

(质量分数)海藻酸钠,6%聚乙烯醇。固定化PW菌降解芘的最适pH值在6郾5~7郾5之间,最适温度约为30益。

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