一、抗体纯化部分

1、 腹水/血清的亚型测定完成后，IgG亚型的腹水/血清使用Protein G 抗体纯化柱纯化；IgM

亚型的腹水/血清则使用饱和硫酸铵沉淀法沉淀。

1.1 Protein G 抗体纯化步骤：

（1）新柱子先用DDW 5ml过柱；

（2）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱；

（3）抗体过柱，过程中要求缓慢过柱，以求抗体蛋白更好的结合在结合位点上；

（4）继续10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱；

（5） 5倍柱体积甘氨酸-盐酸缓冲液（pH 2.7）洗脱结合位点上的抗体，并加入Tris-HCI(pH

9.0)中和甘氨酸，使pH保持为适合抗体保存的中性；

（6）10倍柱体积的Binding Buffer (pH 7.0) 平衡纯化小柱；

（7）5倍柱体积 20%乙醇溶液过柱，于4℃条件下保存纯化小柱；

（8）将洗脱的抗体用聚乙二醇浓缩并透析，以彻底去除不相干离子。

其中所用试剂配方：

DDW：超纯水

Binding Buffer（100ml）：A液，0.2M磷酸氢二钠 61ml

B液，0.2M磷酸二氢钠 39ml

磷酸氢二钠 4.37g 磷酸二氢钠 1.22g

甘氨酸-盐酸缓冲液：0.1M甘氨酸溶液加浓盐酸调pH 2.7

Tris-HCL缓冲液：1M Tris溶液加浓盐酸调pH 9.0

1.2 饱和硫酸铵沉淀法步骤：

（1）配制饱和硫酸铵溶液，再用氨水调节pH至8.5

（2）沉淀：a、腹水/血清离心去除细胞碎片，保留上清液并测定体积；

b、边搅拌边逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀； c、上述蛋白质溶液经过离心弃上清取沉淀，并用PBS溶液（pH 7.0）溶解； d、继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋

白充分沉淀；

e、继续离心沉淀弃上清去沉淀，用PBS溶液（pH 7.0）溶解；

（3）透析：每隔3-6小时换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。

其中所用试剂配方：

PBS缓冲液（1L pH 7.0）：氯化钾 0.2g

磷酸二氢钾 0.2g

磷酸氢二钠 3.35g

氯化钠 8g